活細胞分析儀通過自動化成像、環(huán)境控制與智能分析技術，可系統(tǒng)追蹤小鼠胚胎卵母細胞焦亡過程，其核心流程與功能如下：

一、實驗設計：動態(tài)追蹤焦亡過程

1.樣本準備

將小鼠胚胎卵母細胞接種于培養(yǎng)皿或微孔板中，置于活細胞分析儀的培養(yǎng)箱內（37℃、5% CO?），避免頻繁取出導致的環(huán)境干擾。

2.誘導焦亡

通過藥物（如LPS、化療藥物）或基因編輯（如敲除/過表達焦亡相關基因）誘導細胞焦亡，模擬生理或病理狀態(tài)。

3.定時成像

設置活細胞分析儀的拍攝間隔（如每30分鐘或1小時），連續(xù)記錄72小時以上的細胞動態(tài)變化，捕捉焦亡的關鍵事件（如膜起泡、破裂）。

二、多模態(tài)成像：捕捉焦亡形態(tài)特征

1.明場成像

細胞腫脹與膜破裂：光鏡下觀察細胞體積增大、氣泡狀突起（焦亡小體）及膜完整性喪失。

運動軌跡：記錄細胞遷移或群體行為變化，分析焦亡對胚胎發(fā)育的影響。

2.熒光成像

膜標記：用鈣黃綠素-AM標記活細胞質，Annexin V-FITC標記早期焦亡細胞膜外翻的磷脂酰絲氨酸。

核標記：Hoechst 33342標記細胞核，觀察核濃縮、DNA斷裂等特征。

炎癥因子標記：抗IL-1β-Alexa Fluor 647抗體標記釋放的促炎因子，直觀顯示炎癥反應。

3.三維Z軸堆疊

通過電動Z軸控制重建細胞或胚胎的三維結構，分析焦亡過程中細胞內部器官（如線粒體、內質網）的腫脹與破裂。

三、智能分析：量化焦亡參數(shù)

1.形態(tài)學分析

AI識別：自動識別細胞邊界、焦亡小體數(shù)量及膜破裂時間。

面積變化率：計算細胞面積隨時間的變化，量化腫脹程度。

運動軌跡追蹤：分析細胞遷移路徑，評估焦亡對胚胎動態(tài)的影響。

2.生化特征分析

炎癥小體激活：通過熒光信號定量檢測NLRP3、ASC等炎癥小體組件的組裝。

Caspase活化：Western Blot或熒光探針檢測Caspase-1/4/5/11的切割與激活。

Gasdermin蛋白切割：檢測GSDMD/GSDME的N端片段生成，確認膜孔道形成。

3.炎癥因子釋放

ELISA檢測：定量分析培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-18的濃度，評估炎癥反應強度。

多因子檢測：利用Luminex或MSD技術同時檢測多種炎癥因子，提高通量。

四、經典與非經典通路解析

1.經典通路（Caspase-1依賴）

炎癥小體激活：NLRP3識別病原體或危險信號，招募ASC與Caspase-1形成復合體。

Caspase-1切割：激活后切割GSDMD，產生N端片段形成膜孔道，導致細胞腫脹破裂。

炎癥因子釋放：切割IL-1β/IL-18前體，成熟后釋放至細胞外，招募免疫細胞。

2.非經典通路（Caspase-4/5/11依賴）

直接LPS識別：人源Caspase-4/5或鼠源Caspase-11直接結合細菌LPS，被激活后切割GSDMD。

間接Caspase-1激活：非經典通路可間接激活Caspase-1，放大炎癥反應。

Pannexin-1剪切：Caspase-11剪切Pannexin-1，誘導ATP釋放，進一步加劇焦亡。

五、應用場景與優(yōu)勢

1.胚胎發(fā)育研究

追蹤焦亡對胚胎植入前發(fā)育的影響，分析染色體分離異常與胚胎質量的關系。

評估卵巢刺激對卵母細胞焦亡發(fā)生率的影響，優(yōu)化輔助生殖技術。

2.疾病機制研究

感染性疾?。貉芯坎≡w誘導的焦亡在抗感染免疫中的作用。

神經退行性疾?。悍治鲂∧z質細胞焦亡在阿爾茨海默病中的雙重角色（清除病原體 vs. 引發(fā)炎癥）。

腫瘤免疫：探索化療藥物通過GSDME介導的焦亡在腫瘤清除中的機制。

3.技術優(yōu)勢

長時間連續(xù)監(jiān)測：72小時以上穩(wěn)定運行，捕捉快速動態(tài)過程。

低光毒性設計：紅色LED光源減少光損傷，支持長時間成像。

高通量分析：96孔板自動掃描，單次實驗處理數(shù)百樣本。

AI智能分析：自動識別細胞形態(tài)、量化參數(shù)，減少人為誤差。

總結

活細胞小鼠胚胎卵母細胞的細胞焦亡系統(tǒng)，主要依賴炎癥小體（如 NLRP3）激活，下游 caspase-1/11 介導信號傳遞，促使 GSDMD 蛋白穿孔細胞膜，釋放促炎因子。該過程與卵母細胞發(fā)育階段相關，氧化損傷、病原體入侵等應激可誘導其發(fā)生，參與卵母細胞質量篩選，異常激活則可能影響胚胎發(fā)育潛力，是卵母細胞應激響應的重要調控機制。