一、實(shí)驗(yàn)前核心準(zhǔn)備：靶向適配與樣本預(yù)處理
1. 肝脾靶向藥物 - 造影劑偶聯(lián)制備（關(guān)鍵前提）
肝脾靶向需基于器官特異性靶點(diǎn)設(shè)計(jì)藥物載體：
肝臟靶向：采用半乳糖修飾載體（如半乳糖 - 脂質(zhì)體、半乳糖 - 金納米顆粒），精準(zhǔn)結(jié)合肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞表面的去唾液酸糖蛋白受體（ASGPR）；若靶向肝 Kupffer 細(xì)胞（巨噬細(xì)胞），則選用 100-500nm 的納米載體（天然被巨噬細(xì)胞吞噬）；
脾臟靶向：通過(guò)甘露糖修飾載體（結(jié)合脾臟巨噬細(xì)胞甘露糖受體）或低滲載體（促進(jìn)脾臟竇狀內(nèi)皮細(xì)胞攝?。?；
光聲造影劑標(biāo)記：將藥物與近紅外光聲造影劑偶聯(lián)（如吲哚菁綠 ICG、金納米棒 GNRs），確保造影劑吸收光譜與肝脾組織自體信號(hào)（血紅蛋白 450-580nm、脂質(zhì) 930nm）無(wú)重疊，優(yōu)先選擇 780-850nm 近紅外波段（組織穿透深、背景干擾小），偶聯(lián)后需驗(yàn)證藥物活性（如 ELISA 檢測(cè)靶向結(jié)合率＞80%）與造影劑穩(wěn)定性（4℃儲(chǔ)存 72h 無(wú)聚集）。
2. 小動(dòng)物模型選擇與預(yù)處理（確保生理一致性）
模型選擇：優(yōu)先選用 SPF 級(jí) C57BL/6 小鼠（6-8 周齡，體重 20-25g），肝脾解剖結(jié)構(gòu)清晰、個(gè)體差異??；若研究病理狀態(tài)（如肝纖維化、脾腫大），需構(gòu)建對(duì)應(yīng)模型（如 CCl?誘導(dǎo)肝纖維化小鼠、荷瘤脾小鼠）；
預(yù)處理：實(shí)驗(yàn)前 12h 禁食（避免胃腸內(nèi)容物光聲信號(hào)干擾）、自由飲水；麻醉前 30min 腹腔注射阿托品（0.1mg/kg，減少呼吸道分泌物），確保成像過(guò)程中動(dòng)物呼吸穩(wěn)定。
二、光聲成像系統(tǒng)參數(shù)優(yōu)化：匹配肝脾組織特性
1. 激發(fā)波長(zhǎng)與光譜解混參數(shù)設(shè)定（核心技術(shù)適配）
單波長(zhǎng) / 多波長(zhǎng)選擇：
若僅追蹤藥物 - 造影劑分布，選擇造影劑特征吸收波長(zhǎng)（如 ICG 選 808nm、GNRs 選 820nm），避開(kāi)肝脾組織自體吸收峰；
若需同步監(jiān)測(cè)肝脾血流（輔助判斷藥物遞送效率），采用多波長(zhǎng)掃描（700-900nm），通過(guò)光譜解混算法分離 “藥物 - 造影劑信號(hào)”“氧合血紅蛋白信號(hào)（532nm）”“去氧血紅蛋白信號(hào)（550nm）”，避免信號(hào)疊加；
激光參數(shù)校準(zhǔn)：激光能量密度控制在 20-40mJ/cm2（低于小鼠皮膚損傷閾值 60mJ/cm2），脈沖重復(fù)頻率設(shè)為 15Hz，平衡成像速度（單幀＜0.3s）與信噪比（SNR＞35dB），確保肝脾深部（肝臟厚度約 5-8mm、脾臟約 3-5mm）信號(hào)清晰。
2. 成像模式與視野適配（覆蓋靶向器官）
肝臟成像：采用俯臥位固定小鼠（腹部朝上），調(diào)整載物臺(tái)使成像視野覆蓋整個(gè)肝臟（約 15mm×10mm），選擇 2D 動(dòng)態(tài)掃描模式（時(shí)間間隔 1min / 幀）追蹤藥物實(shí)時(shí)分布，或 3D 容積掃描（層厚 50μm）定量藥物在肝小葉的空間分布；
脾臟成像：切換仰臥位（左側(cè)朝上），視野聚焦脾臟區(qū)域（約 8mm×6mm），因脾臟信號(hào)易受腸道氣體干擾，可通過(guò)輕微調(diào)整體位（抬高小鼠左后肢）或提前灌胃二甲硅油（減少腸道氣體）優(yōu)化成像質(zhì)量。
三、實(shí)驗(yàn)操作執(zhí)行：動(dòng)態(tài)追蹤與生理監(jiān)控
1. 動(dòng)物麻醉與體位固定（保障成像穩(wěn)定性）
麻醉方案：采用異氟烷吸入麻醉（誘導(dǎo)濃度 5%，維持濃度 1.5%-2%），搭配恒溫加熱墊（37±0.5℃）維持體溫，避免低溫導(dǎo)致肝脾血流減緩（影響藥物分布）；
精準(zhǔn)固定：使用定制小鼠固定裝置（含牙齒固定器、四肢卡扣），確保成像過(guò)程中動(dòng)物無(wú)位移（位移＞0.1mm 會(huì)導(dǎo)致圖像配準(zhǔn)誤差），同時(shí)暴露肝脾對(duì)應(yīng)腹部區(qū)域（剃毛后涂抹超聲耦合劑，增強(qiáng)光聲信號(hào)傳導(dǎo)）。
2. 藥物給藥與動(dòng)態(tài)成像時(shí)序（捕捉關(guān)鍵分布節(jié)點(diǎn)）
給藥方式：根據(jù)藥物載體特性選擇給藥途徑 —— 靜脈注射（尾靜脈，適合快速靶向肝脾，注射速度＜0.1mL/s 避免靜脈破裂）或腹腔注射（適合緩慢釋放型載體，給藥后 1h 開(kāi)始成像）；
成像時(shí)間點(diǎn)設(shè)計(jì)：
早期分布（0-1h）：每 10min 采集 1 次，捕捉藥物在肝脾的快速富集過(guò)程（如肝臟 ASGPR 靶向藥物通常 15-30min 達(dá)峰）；
中期滯留（2-6h）：每 30min 采集 1 次，分析藥物在肝脾的代謝速率；
長(zhǎng)期清除（12-24h）：每 2h 采集 1 次，評(píng)估藥物清除半衰期；
生理參數(shù)同步記錄：實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠心率（300-500 次 / 分）、呼吸頻率（60-120 次 / 分），若參數(shù)異常（如心率＜250 次 / 分）立即調(diào)整麻醉濃度，避免生理狀態(tài)波動(dòng)影響藥物分布。
四、數(shù)據(jù)處理與定量分析：確保結(jié)果可靠性
1. 圖像預(yù)處理與信號(hào)分離（排除干擾）
背景降噪：采用高斯濾波（標(biāo)準(zhǔn)差 1-2 像素）去除隨機(jī)噪聲，通過(guò)幀平均（3-5 幀平均）提升 SNR；
光譜解混：利用系統(tǒng)自帶解混算法（如非負(fù)矩陣分解 NMF），基于 “藥物 - 造影劑” 與 “肝脾組織” 的標(biāo)準(zhǔn)吸收光譜，分離出純藥物信號(hào)，消除血紅蛋白、脂質(zhì)的背景干擾（解混后藥物信號(hào)純度＞90%）；
圖像配準(zhǔn)：對(duì)動(dòng)態(tài)成像序列進(jìn)行剛性配準(zhǔn)（基于肝臟門靜脈、脾臟邊緣等解剖標(biāo)志點(diǎn)），校正動(dòng)物呼吸導(dǎo)致的肝脾位移（配準(zhǔn)誤差＜50μm）。
2. 定量指標(biāo)計(jì)算（量化藥物分布）
區(qū)域信號(hào)強(qiáng)度（PAI）：在肝脾 ROI（感興趣區(qū)域，如肝臟右葉、脾臟紅髓區(qū)）內(nèi)計(jì)算平均 PAI 值，通過(guò)預(yù)構(gòu)建的 “PAI - 藥物濃度” 標(biāo)準(zhǔn)曲線（用含不同濃度藥物 - 造影劑的瓊脂體模制作，R2＞0.98），換算成肝脾組織內(nèi)藥物濃度（單位：μmol/g）；
靶向效率評(píng)估：計(jì)算 “肝 / 血藥物濃度比”“脾 / 血藥物濃度比”（血藥濃度通過(guò)同期取少量尾靜脈血檢測(cè)），以及 “肝靶向率”（肝臟藥物總量 / 總給藥量 ×100%）、“脾靶向率”，靶向效率＞50% 視為有效靶向；
空間分布均勻性：通過(guò) 3D 成像的信號(hào)強(qiáng)度熱力圖，分析藥物在肝脾內(nèi)的分布差異（如是否富集于肝小葉中央靜脈周圍、脾臟白髓區(qū)）。
五、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與質(zhì)控：確保結(jié)果可信度
1. 組織水平驗(yàn)證（金標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照）
成像結(jié)束后處死小鼠，取肝脾組織進(jìn)行：
冷凍切片熒光成像：若藥物 - 造影劑兼具熒光特性（如 ICG），通過(guò)熒光顯微鏡觀察藥物在肝脾組織的定位（與光聲成像結(jié)果對(duì)比，吻合度需＞85%）；
高效液相色譜（HPLC）或電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）：直接檢測(cè)肝脾組織內(nèi)藥物濃度，驗(yàn)證光聲定量結(jié)果的準(zhǔn)確性（誤差需＜10%）。
2. 系統(tǒng)與實(shí)驗(yàn)質(zhì)控
設(shè)備校準(zhǔn)：每次實(shí)驗(yàn)前用標(biāo)準(zhǔn) phantom（含 10μmol/L ICG 的瓊脂體模）校準(zhǔn)光聲系統(tǒng)靈敏度，確保不同批次實(shí)驗(yàn)的信號(hào)一致性（RSD＜5%）；
重復(fù)與對(duì)照設(shè)置：每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置 3-5 只小鼠（減少個(gè)體差異），同時(shí)設(shè)置 “非靶向藥物組”（如未修飾載體）與 “空白對(duì)照組”（僅注射生理鹽水），通過(guò)對(duì)比凸顯肝脾靶向特異性。
總結(jié)
小動(dòng)物光聲成像系統(tǒng)研究肝脾靶向藥物分布的關(guān)鍵，在于 “靶向載體 - 造影劑適配”“系統(tǒng)參數(shù)與肝脾特性匹配”“動(dòng)態(tài)追蹤與定量驗(yàn)證結(jié)合”。通過(guò)嚴(yán)格執(zhí)行上述步驟，可精準(zhǔn)捕捉藥物在肝脾的富集、滯留、清除過(guò)程，為肝脾疾?。ㄈ绺窝?、脾功能亢進(jìn)）的靶向藥物研發(fā)提供 “無(wú)創(chuàng)、動(dòng)態(tài)、定量” 的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，推動(dòng)靶向藥物從臨床前研究向臨床轉(zhuǎn)化。
